愈宠大健康 | V+科研中心——日粮添加蔓越莓对犬尿路大肠杆菌的黏附性研究

2024.02 第一期

　　本文的通讯作者为Patrick Di Martino，是法国塞吉蓬图瓦兹大学ERRMECe实验室的一名生物学教授。他通过向犬日粮添加蔓越莓提取物的一个实验，证明了蔓越莓提取物可以明显抑制雌性犬泌尿道中的致病性大肠杆菌的繁殖，对泌尿道具有一定的保护作用。

　　尿路感染(urinary tract infections，UTIs)是指病原微生物在尿液中的定植和尿道组织的感染。尿路主要包括从尿液形成部位、肾小球、尿液排出部位延伸至尿道口，因此，尿道、膀胱、输尿管、肾盂、肾脏及其邻近组织是微生物最为易感的组织。临床上，根据感染部位的不同，将尿路感染分为膀胱炎、尿道炎、肾盂肾炎等（图１）。

图1 尿路感染部位1

　　大肠杆菌包括产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic E. coli，ETEC）、肠致病性大肠杆菌（enteropathogenicE E. coli，EPEC）、肠侵袭性大肠杆菌（enteroinvasive E. coli，EIEC）、肠黏附性大肠杆菌（enteroaggregative E. coli，EAEC）、贴壁大肠杆菌（attaching-effacing E. coli，AAEC）、弥散黏附性大肠杆菌（diffusely adherentco E. coli，DAEC）和产志贺毒素的大肠杆菌（shiga toxin-producing E. coli，STEC）。肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal pathogenic E. coli，ExPEC）包括尿路致病大肠杆菌（uropathogenic E. coli，UPEC）和脑膜炎相关大肠杆菌（meningitis associated E. coli，MAEC）。

　　尿路感染(UTIs)是宠物下泌尿道综合征中常见的一种疾病。其中，尿路感染的常见致病菌是尿路致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli，UPEC)（图2）。宠物源UPEC不仅对宠物危害巨大，同时还存在通过宠物感染人的可能，其中以大肠杆菌诱发的膀胱炎最为常见。

图2 大肠杆菌相关黏附素和运动结构1

　　尿路致病大肠杆菌毒力基因：

　　黏附素：UPEC拥有的黏附素包括Ⅰ型、P型、S型、M型、Dr型菌毛和FIC型。不同的菌毛结合不同宿主受体，造成不同区域的尿路感染。

　　毒素：α-溶血素和细胞坏死因子（CNF1）。大肠杆菌α-溶血素是重复子毒素家族（RTX）成员；CNF1则在UPEC的发病机制中发挥潜在作用。铁摄取系统：铁是细菌生长代谢中必需营养物质。大肠杆菌摄取铁的机制主要有产生铁结合性复合物和溶血素两种。其中，铁结合性复合物有分为两种：气杆菌素和肠菌素。

　　蔓越莓（vaccinium macrocarpon）又被人们称作小红莓，是一种生长在灌木上的鲜红小圆果，直径约1cm，重酸微甜。蔓越莓在美国东部和东北部以及加拿大大部分地区种植，在中国的大兴安岭地区以野生为主。2015年黑龙江省佳木斯市抚远市开始规模化人工种植。蔓越莓中的花青素/原花青素生物复合物通常被认为是有效的抗黏附化合物，动物体内实验早已证实蔓越莓提取物在预防尿路感染方面具有突出效果。原花青素又称为浓缩单宁酸，约占蔓越莓酚类总含量的63%～71%。其它浆果类水果的原花青素是B型连接的黄烷键，蔓越莓中的原花青素则是含有一个或多个A型的黄烷键。A型黄烷键能够与细菌纤毛的外源性凝结素相抵触，从而使细菌无法与细胞受体结合，通过竞争性直接抑制大肠杆菌菌毛黏附到尿路上皮细胞。因为富含A型黄烷键结构的原花青素成分的植物十分稀少，所以预防泌尿道感染是蔓越莓特有的无副作用的保健功效。

　　目前蔓越莓预防UTI的机制有三个被普遍认可的假说：

　　1、其富含的原花青素可以改变UTI主要病原体UPEC对尿道上皮细胞（HUC）黏附能力，通过改变细菌的P-菌毛结构或与细菌的P-菌毛结合，使其难以附着在尿路和膀胱的细胞上，从而随尿液被排出体外。

　　2、抑制大肠杆菌鞭毛的活性，降低细菌的整体运动能力。

　　3、具有毒力因子，抑制细菌入侵。

　　材料与方法：

　　实验动物：

　　试验方法：

　　每只犬饲喂满足基础生长所需量的普通犬粮，第10天收集24小时内所有自然排空的尿液作为对照，编号为U1-8；第十一天饲喂添加了0.2%蔓越莓粉（20ppm原花青素）的普通犬粮，第20天收集24小时内所有自然排空的尿液，编号为UCR1-8。所有尿液样本收集后放置于-20°C冰箱保存，用于后续分析。试验期间没有介入药物，没有饲喂其它食物，自由饮水。

　　收集的尿液样本于4℃解冻经过离心后过滤灭菌，用于UPEC的体外细胞黏附实验，每个尿液样本进行4次重复实验，对统计数据进行t测验和方差分析。

　　结果：

图3蔓越莓提取物对UPEC粘附MDCK细胞的抗黏附作用

A -UPEC未感染MDCK细胞；B - UPEC在尿样本U8中生长后对MDCK细胞的黏附；C –UPEC在UCR8尿液样本生长后对MDCK细胞的黏附。红色箭头:黏附细菌

　　图3A所示为MDCK细胞未感染UPEC，在尿液样本U1-U8中培养后，MDCK细胞表面黏附了大量的UPEC细菌（图3B），而在犬食用含有蔓越莓提取物的日粮之后，尿液样本中MDCK细胞黏附的UPEC大大减少（图3C）。

表1 G1473 UPEC菌株对MDCK细胞系的黏附指标

　　表1反映了UPEC菌株G1473在犬只尿液样本中培养后黏附指数的变化。饲喂普通日粮之后，UPEC细菌对MDCK细胞的黏附指数在每个细胞3.07至11.04个细菌之间，而食用蔓越莓提取物补充剂后，UPEC细菌黏附指数在2.10至5.78之间。对照组，在尿液样本U7中培养的UPEC细菌表现出了最高的黏附指数(11.04个细菌/ MDCK细胞)。实验组尿液样本UCR5中生长的UPEC细菌表现出了最低的黏附指数(2.10个细菌/ MDCK细胞)。对照组8只犬尿液中细菌培养后的黏附指数平均值为5.65±2.39个细菌/ MDCK细胞，4只雄性犬（U1 ~ U4）和4只雌性犬（U5 ~ U8）的黏附指数平均值分别为3.82±0.65和7.48±1.99。实验组的UPEC黏附指数显著低于对照组( P < 0.001 ) 。实验组8只犬尿液中UPEC培养后的黏附指数平均值显著降低至3.91±0.95 (P < 0.001 ) 。

　　讨论

　　本次研究使用了可感染人的G1473菌株，通过实验证明该菌株也可感染犬的尿路上皮细胞，这种情况说明一些肠外致病性大肠杆菌存在人宠共患的可能。并且饲喂蔓越莓提取物可以显著减少致病性大肠杆菌对MDCK的黏附性，可以减少约50%的泌尿上皮细胞细菌数。这种抑制作用可能存在个体差异性，表现在雌性犬的抑制作用明显大于雄性犬。

　　一项研究显示：在过去一年有两次或者两次UTI发作的182名女性中，持续6个月，每天服用500mg/d蔓越莓，尿路感染显著减少2。蔓越莓不仅对妇女有效果，对儿童也有效果。另一项研究表明，服用蔓越莓胶囊的儿童复发性尿路感染的比例也显著降低，并且没有任何副作用3。《日本JAID/JSC感染治疗指南2015版—尿路感染与男性生殖感染》一指出，妇女绝经后每天摄入65%蔓越莓汁可预防复发性膀胱炎。Bruyère等4组合使用蜂胶和蔓越莓治疗女性反复发作膀胱炎，取得显著治疗效果，并且能够阻断上行感染，避免了进一步UTI的发生。蜂胶增强了蔓越莓花青素在UPEC粘连、运动和生物膜形成、铁离子代谢和胁迫响应方面的作用5。Montors等6在一项初步研究中证实了联合摄入蔓越莓、鼠李糖乳杆菌和维生素C对预防复发性尿路感染的有效性。体外研究显示240mL蔓越莓鸡尾酒，可防止80%的大肠杆菌分离物的黏附，而且这种效果可持续摄入后10h7。若采用果汁形式服用进行治疗，有研究指出平均每天摄入300mL蔓越莓果汁(含36mg原花青素)可降低UTI8。若以蔓越莓粉形式服用，每天需要72g原花青素才能防止尿路中的细菌黏附9。

　　参考文献（略）